如何选择逆转录酶？

一、逆转录酶的类型：

逆转录酶（Reverse Transcriptase），又称反转录酶，RT酶。逆转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）的酶。

自然界中存在多种逆转录酶，目前研究较多的逆转录酶有下面几种：

人类免疫缺陷病毒1型HIV-1逆转录酶（PDB:1HMV)：有两个亚基，分别具有66和51kDa的分子量。人类免疫缺陷病毒又称艾滋病病毒。

来自禽成髓细胞瘤病毒的AMV逆转录酶，具有两个亚基，63kDa亚基和95kDa亚基。

来自莫洛尼鼠白血病病毒的MMLV逆转录酶，是单个75kDa的单体。

端粒酶逆转录酶，维持真核染色体的端粒。

其中，AMV和MMLV是分子PCR检测常用的两种逆转录酶。

二、AMV和MMLV两种逆转录酶的区别：

首先，两种转录酶的来源不同，AMV来自禽成纤维病毒逆转录酶，MMLV来自鼠白血病逆转录酶；

其次，它们的反应温度不同：AMV的热稳定性较高，反应温度可达55℃，对次级结构耐受；MMLV的热稳定性较低，适温度为37℃；

此外，RNaseH活性也不同：AMV的RNaseH活性比MMLV高，由于RNaseH活性同反转录酶的聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA（DNA复合物中的RNA链）。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度，这点来说AMV不如MMLV效果好。

总的来说，虽然AMV的热稳定性好，对抗二级结构和高GC的能力强，但其合成cDNA的长度短，得率低，因此MMLV是市场主流产品。目前，野生型MMLV已可以通过基因改造弥补这些不足。

表1  AMV和MMLV（野生型）的区别

三、如何选择逆转录酶

1、RNase H活性要低

RNase H活性强会导致RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解，因此实验中需要规避这一点。此外，RNase H活性还可能会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争从而降低逆转录效率。为了更好地合成cDNA，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变，逆转录酶的RNase H活性降低甚至完全消除。这种突变通常可以增加长链cDNAs的产量，促进其合成。

2、合成能力要高

合成能力高的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链。逆转录酶的合成能力与其对RNA模板的亲和力有关，具有高合成能力的逆转录酶对可能来源于RNA的常见抑制剂具有抗性。这些抑制剂包括来自血液和粪便的肝素和胆汁盐，来自土壤和植物的腐殖酸和多酚，以及来自福尔马林固定，石蜡包埋（ffpe）样品的福尔马林和石蜡。它们通常与RNA竞争性结合，间接降低逆转录酶的合成活性。而具备高合成能力的逆转录酶能够更好地克服这种抑制，在面对低质量和低丰度的RNA样品时，高合成能力的逆转录酶仍然表现更好。

3、耐高温能力要强

逆转录酶的主要功能取决于RNA依赖性DNA聚合酶和RNase H酶活性，但逆转录酶的耐高温能力是cDNA合成的重要影响因素。传统MMLV不耐高温，只能在相对较低的温度（37℃）下维持其酶活性。反应温度的升高有助于使具有坚固二级结构和/或高GC含量的RNA变性，并且提高引物与目标基因结合的特异性，使得逆转录酶能够读取序列，从而能够实现全长cDNA的合成，产量更高，RNA也能够更好的逆转录为cDNA。不少国外厂家如Q、T、国内的BIOG都已有性能不错的逆转录酶产品。