原位杂交技术已经成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。做过原位杂交实验的小伙伴都知道，影响实验成败的因素有很多，我们以地高辛标记法（PCR法）的原位杂交技术为例来为大家解答一些实验中的问题。
1、地高辛标记探针的长度和浓度分别为多少合适？
探针的标记长度应小于2.5 kb，佳标记长度在 0.15 kb-0.95 kb 之间，片段过长易导致非特异杂交；片段短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短，但片段过短往往会降低检测灵敏度。
探针浓度依其种类和实验要求略有不同，一般为0.5-5.0 ug/mL（0.5-5.0 ng/ uL）。适宜的探针浓度还需通过实验才能确定。有的试剂盒也人性化的标注了如何调整探针的使用量，如BIOG地高辛标记试剂盒给出的调整方案：如PCR标记的探针条带清晰，无杂带，可不需纯化，变性后直接加入预杂交液中使用，一般1mL预杂交液加入2 uL PCR标记探针即可，如发现杂交背景较深，可减少探针用量至0.5-1.0 uL/mL杂交液，如杂交信号较弱，则可适当增加探针的加入量。
2、在原位杂交中，用PCR法进行地高辛标记探针时，应该加入多少模板量？
用PCR法进行地高辛标记，模板浓度是产生特异性探针的关键因素。根据市面上两款主流产品Roche和BIOG地高辛标记试剂盒的说明书推荐，模板的加入量为基因组DNA在1-50 ng之间，质粒DNA在10-100 pg之间为宜。
对于大多数模板来说，使用量不应超过上述规定。过多的模板会导致初级延伸产物（经过结合位点复制的产物）的共扩增。这些初级延伸产物可能包含重复序列或来自二级结合位点（由基因组DNA制备）或载体序列（由质粒DNA制备）的不相关产物。在随后的杂交试验中，探针与靶标的杂交产物会因为探针会与载体或基因组 DNA 序列发生交叉杂交而形成拖尾。实验者若想得出适用量，可使用普通PCR进行摸索。
3、原位杂交中，模板量有限，但是想要制备足量的高特异性探针，有什么试剂盒比较好用呢？
在模板量较少的情况下，想要制备足量的高特异性探针，选用PCR标记试剂盒。PCR对标记模板的量和纯度都要求不高，相比较而言，随机引物法的要求就比较高。对于PCR法的探针标记试剂盒，建议选用配置热启动Taq酶的标记试剂盒。与普通Taq酶相比，热启动Taq酶具有扩增效率高，非特异扩增少，标记效率高的显著优势。
就我们实验室的使用体验来说，BIOG地高辛标记试剂盒中使用了超级热启动Taq酶，这种酶相对于知名品牌R的同类试剂盒所用的普通Taq酶来说，具有更好的扩增效率和特异性。据了解，超级热启动Taq酶是经过严格化学封闭的，因此可减少因引物模板错配以及引物二聚体形成等导致的非特异性标记，探针标记特异性高，模板量少的情况下，也能够制备出大量的高活性的地高辛标记探针。
4、原位杂交实验中出现非特异性染色，这是怎么一回事呢?
非特异性染色的原因可能是来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等。探针特异性不高或是组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。BIOG地高辛标记原位杂交检测试剂盒中的Blocking Reagent，可有效封闭非特异性核酸探针结合位点，较大程度地降低原位杂交的背景；配套BIOG地高辛标记试剂盒使用，可获得高特异性的探针，杂交效果更好。此外，背景颜色深的原因还可能是探针浓度过高，信号产生过剩；切片在孵育中干涸；切片未冲洗或冲洗时间过短。而着色浅则可能为试剂未预温或室温低，可延长孵育时间；探针或靶核酸变性不足，可延长变性时间；杂交不完全，可延长杂交时间。
