从事生物试剂公司的技术岗已有多年，常常会收到来自客户各种问题的反馈，其中关于siRNA转染试剂产品，问的最多的就是“为什么我做出来的结果没有你们说的好？”。这是一个不太好回答的问题。实际上，主要原因还是客户操作的问题。比如，实验条件没有充分优化、没有按照说明书要求操作、实验操作不够熟练细心，等等。下面我们就结合几个具体的客户案例来分析一下，希望对同学们有所帮助。
案例一：上海某医学院研究生使用RFect V2转染人结肠癌细胞SW480，反馈目的基因siRNA敲低效果不够理想，求助解决方案。
案例详情：客户购买之前，通过SCI文献了解到RFect V2能在SW480细胞中做到90%以上的敲降效果，因此自己做不出来时便产生了怀疑。在收到该反馈后，我们随即让客户详细填写了《siRNA转染技术沟通信息表》。根据所填内容我们发现了其中的关键问题--客户没有按照Rfect V2的说明书进行操作，而是表面上使用了Rfect V2转染试剂，在实际操作上却使用了之前用过的lipo3000的转染方案：如在转染前将培养基换成无血清培养基、转染时细胞密度达到了80%、配制转染复合物时没有使用Rfect V2试剂盒内的Trans Enhencer而是Opti-MEM、转染后6小时更换了新鲜培养基。不太明白客户当时的心态，但这样的操作不仅增加了实验的麻烦实际上又降低了转染效率。我们跟该研究者进行了详细沟通，委婉地指出了存在的问题并提出了改进建议。一周后，我们收到了他的好消息，改进后目的基因的敲除效率达到了93%，下面是客户反馈的荧光图（图1）。
图1. 上海研究者提供的RFect V2转染FAM-NC到SW480细胞荧光图。
上述这个案例非常典型，有相当一部分客户都会存在这样的问题。为什么会出现这种现象，我们推测，可能有以下原因：1、过于相信国外品牌的性能，但实际上对于siRNA转染试剂来说，国内品牌特别是Rfect V2 siRNA转染试剂的性能经过客户多年使用，已充分证明其性能已达到或超过国外某些权威品牌的性能。如果客户要比较两者的优劣，也应该按各自的说明书严格操作，不能使用了一家的转染试剂，却按照另一家的流程去操作。2、操作习惯的问题，有些客户过去经常使用Lipo3000或RNAiMAX进行siRNA转染，因而已经形成了转染后6小时换液的习惯，形成了配制转染复合物要使用Opti-MEM的习惯，在换用Rfect V2 转染试剂时，操作思路没有及时切换。他们没有意识到，使用国产Rfect V2根本不需要如此繁琐的操作就可以取得理想的实验结果。
主要问题：未按说明书要求认真进行转染实验，混用其他试剂的转染方案。
启示：不要根据过去的习惯进行实验，要认真阅读说明书，严格按照每种试剂的操作说明进行实验。
案例二：武汉某高校研究生使用RFect V2转染人肝癌细胞HepG2，反馈转染NC-FAM后显微镜下看不到荧光点，认为没有转染进去。
案例详情：根据客户反馈的荧光图来看，荧光背景非常强（呈现较刺眼的绿色背景），和正常的荧光图背景相比差别较大，显然在观察荧光前没有使用PBS或细胞培养基进行背景洗涤，转染进细胞内的siRNA荧光由于受细胞内物质遮蔽因而普遍弱于细胞外的荧光强度，致使观察时无法辨认清晰而产生未转染进去的误判。并且，如果不进行清洗，细胞表面会吸附荧光标记的siRNA和细小的荧光颗粒，有时又会导致错误的转染阳性判断。经此沟通，客户听取并接受了建议，在用PBS洗涤两次后重新进行荧光观察，获得了和此前截然不同的实验结果（图2）。
主要问题：未进行背景洗涤后观察荧光效果，导致误判。
启示：荧光背景很强的情况下，不利于观察siRNA转染阳性率，建议使用PBS洗涤后观察。
图2.RFect V2转染FAM-NC到HepG2细胞，24h荧光图。
案例三：北京高校某医学院博士使用RFect V2转染人宫颈癌细胞Hela，反馈和lipofectamine3000转染的荧光图对比，lipofectamine3000转染出来的荧光更加明亮，但目的基因的敲除效率只有76%，RFect V2的荧光较弱，但目的基因的敲除效率却有92%，他感到比较困惑。
案例详情：我们认真看了客户的荧光图，两款试剂的转染阳性率均达到了90%以上，但显然lipofectamine3000的荧光更加明亮。同类问题也有一些其他高校的同学问过，我们实验室也做过比对研究。造成该现象的主要原因在于两款试剂的成分不同，因而转染后所呈现出来荧光效果有所差异。Lipofectamine3000主要为阳离子脂质体成分，这种成分不易降解且具有较高的电荷强度，更适合于质粒这种大分子的胞内递送，而对于siRNA这类小核酸来说，其高强度电荷会将很多siRNA紧密吸附，出现不易使siRNA在胞内充分释放的情况。因此研究者在转染带荧光标记的siRNA时，由于荧光在细胞内聚团得不到及时释放，观察的时候荧光效果就看起来非常明亮，但由于siRNA没有充分释放，目的基因的敲除效率就不尽理想。不同的是，RFect V2是以可降解生物纳米材料研发的，是专业转染小核酸的转染试剂，在转染siRNA进入细胞后，试剂自身会很快降解从而快速充分地释放出siRNA，但siRNA本身就是小片段，因此释放到细胞质中的时候，我们在荧光显微镜下观察到的就是有些折光、分散于细胞质的点状荧光，这也就是为什么RFect V2的荧光看起来较弱而目的基因敲除效率却很高的原因。这提示我们，生物科研实验的逻辑关系比较复杂，不能只考虑量效关系这种比较表层的逻辑，还要考虑更深层次的影响因素和逻辑分流现象。
主要问题：认为可以通过siRNA转染的荧光强弱来判断转染效率。
启示：荧光强往往意味着带荧光标记的siRNA聚团而未得到有效释放，因而目的基因的siRNA也极大可能无法被充分释放出来发挥敲降作用，只有通过RT-qPCR检测目的基因的沉默效率才是判断siRNA转染试剂转染效率的金标准。
